MANUEL DE MICROBIOLOGIE
TRAVAUX PRATIQUES - PARTIE GÉNÉRALE MÉDECINE GÉNÉRALE, SECTION FRANÇAISE
Auteur principal : Assis. Univ. Dr. Mihaela-Diana Popa Auteur secondaire : Axel Balogh de Manko-Bük
Coordonnateur : Prof. Dr. Monica Licker
UNIVERSITATÉ DE MÉDECINE ET DE PHARMACIE
“VICTOR BABEŞ” TIMIŞOARA
MANUEL DE MICROBIOLOGIE
TRAVAUX PRATIQUES - PARTIE GÉNÉRALE MÉDECINE GÉNÉRALE, SECTION FRANÇAISE
Auteurs: Assis.Univ. Dr. Mihaela-Diana Popa Axel Balogh de Manko-Bük Coordonnateur: Prof. Dr. Monica Licker
Editura „Victor Babeş”
Timişoara, 2019
Editura „Victor Babeş”
Piaţa Eftimie Murgu 2, cam. 316, 300041 Timişoara Tel./ Fax 0256 495 210
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ISBN 978-606-786-141-9
ISBN vol. 1: 978-606-786-142-6
Table des matières
1) Organisation et fonctionnement du laboratoire de microbiologie, les normes
de protection du travail. ... 5
1.1) Équipement : ... 5
1.2) Normes de protection du travail ... 8
2) Stérilisation ... 9
2.1) La classification des méthodes de stérilisation ... 10
2.2) La préparation du matériel pour la stérilisation ... 14
2.3) Le stockage et conservation du matériel stérilisé, après une opération de stérilisation ... 15
2.4) Contrôle de la stérilisation ... 16
3) Antiseptiques et désinfectants ... 18
3.1) Définitions ... 18
3.2) Nettoyage... 19
3.3) Désinfection ... 19
4) Milieux de culture ... 26
4.1) Composition des milieux de culture ... 27
4.2) Classification des milieux de culture... 28
5) Les principes généraux pour le diagnostic de laboratoire des infections ... 36
6) La récolte et le transport d’échantillons ... 38
7) L’examen direct des produits pathologiques ... 47
7.1) L’examen macroscopique : ... 47
7.2) L’examen microscopique : ... 48
8) Isolation des germes sur milieu de culture, à partir d’un prélèvement ... 52
8.1) Culture à partir d’un produit normalement stérile ... 53
8.2) Culture à partir d’un produit colonisé par la flore normale ... 56
9) Les méthodes d’identification des germes ... 58
9.1) Les méthodes d’identification basées sur les caractéristiques morpho-tinctoriales des frottis colorés à Gram ... 58
9.2) Les méthodes d’identification basées sur les caractéristiques culturelles ... 58
9.3) Les méthodes d’identification basées sur les tests biochimiques et les tests de pathogénicité ... 60
9.4) Les méthodes d’identification basées sur les tests moléculaires ... 61
10) L’antibiogramme, technique et interprétation ... 62
10.1) Techniques d’antibiogrammes ... 63
11.) Réactions antigène-anticorps... 67
11.1) Réaction d’agglutination ... 67
11.2) Réaction avec des anticorps marqués ... 67
12. ) Méthodes de diagnostic rapides, en laboratoire de microbiologie ... 70
12.1) Méthodes basées sur l’identification des acides nucléiques ... 70
Bibliographie ... 72
1) Organisation et fonctionnement du laboratoire de microbiologie, les normes de protection du travail.
Établir l'existence de micro-organismes pathogènes ou saprophytes dans les produits pathologiques (l'isolation, l'identification et l'étude de leur biologie) se fait dans des laboratoires de microbiologie.
Selon le domaine d'investigation, il existe des laboratoires de microbiologie avec des profils différents, comme par exemple, les laboratoires de microbiologie médicale, de microbiologie de l'environnement (air, sols, eaux), de microbiologie alimentaire, industrielle, etc.
Le rôle du laboratoire de microbiologie médicale est multiple:
- Dans le diagnostic des infections,
- Dans la chimiothérapie antibiotique la plus appropriée, - Dans le contrôle de l’efficacité des traitements appliqués, - Dans le dépistage des porteurs sains.
Le rôle essentiel d’un laboratoire de microbiologie médicale, dans un hôpital, consiste en la détermination d’un diagnostic étiologique d’une infection, et le contrôle permanent du potentiel nosocomial dans une unité sanitaire.
Le médecin de laboratoire/microbiologiste/biologiste a comme rôle de faire la corrélation entre la signification clinique et l’analyse de laboratoire.
L’activité optimale d’un laboratoire de microbiologie repose alors sur 4 composantes :
- Le médecin de laboratoire/microbiologiste/biologiste, - Le clinicien,
- Le personnel qualifié, - L’équipement.
1.1) Équipement :
Comme dans l'autres laboratoires, le laboratoire de microbiologie doit avoir un
Dans l’idéal, cet espace doit comprendre :
Des salles de laboratoire spécifiques:
- Une salle de réception et d'enregistrement des échantillons.
- Une salle pour la conservation des produits biologiques, - Une salle de travail,
- Une salle de préparation des milieux de culture, - Une salle de nettoyage du matériel infectieux, - Une chambre de stérilisation,
- Une salle de stockage du matériel,
- Une salle de stockage des réactifs et des milieux de culture, - Un groupe sanitaire.
Des installations adéquates:
- L'eau courante, chaude et froide.
- Le gaz.
- L’électricité.
Mobilier nécessaire:
- Des plans de travail.
- Chaises.
- Armoires.
Microscopes:
Le laboratoire doit être doté de microscopes performants car la microscopie est le premiers pas dans le diagnostic bactériologique.
Les types de microscopes les plus utilisés sont :
- Les microscopes à lumière de fond, - Les microscopes à fond noir,
- Les microscopes à contraste de phase, - Les microscopes à lumière UV.
Verrerie de laboratoire:
- Lames et lamelles,
- Éprouvettes de différentes dimensions,
- Pipettes graduées, de dilution, automatique et semi-automatique, - Tubes en verre,
- Bouteilles,
- Tubes de centrifugation, - Baguette de verre, etc.
Instruments de laboratoire:
- Bec à gaz (qui produit une flamme à la température de700-1000°C), - Anses bactériologiques : bouclées, droites, calibrées,
- Seringues,
- Loupes simples, loupes binoculaires, - Pinces, ciseaux, scalpels, etc.
- Kit de coloration.
- Boite à déchets DASRI.
Equipement de laboratoire de microbiologie:
- Autoclave, - Four Pasteur, - Thermostat, - Réfrigérateur, - Congélateur,
- Balance de précision, - Ordinateur,
- Centrifugeuse.
Figure 1 : Récipient pour les déchets piquants ou coupants et boite pour les déchets à risque biologique.
1.2) Normes de protection du travail
L’activité du laboratoire doit être réalisée comme un circuit de travail partant du prélèvement de produit pathologique et arrivant à l’obtention de résultats.
Il doit être organisé de façon à réduire, le plus possible, la probabilité d’erreurs de la part des manipulateurs.
Il faut éviter toute possibilité de contamination des prélèvements ainsi que du personnel médical qui manipule les produits, ou de transmission d’une infection à d’autres personnes.
Mesures obligatoires :
Le port de matériel de sécurité : blouse, gants, masque.
La répartition judicieuse des appareils et du matériel de laboratoire pour une économie de mouvements, et de déplacements inutiles.
Prévenir les défaillances ou accidents par :
- Préparation de matériel de réserve,
- La notation correspondante des produits et récipients utilisés.
La manipulation correcte du matériel infectant (récolte, examen, ensemencement, inoculation, etc.) se réalise en respectant les normes d’asepsie:
- Utilisation d’une flamme (pour stériliser les anses et la bouche des récipients) - Utilisation de récipients, placés sous la table, pour jeter les emballages, déchets infectieux et déchets piquant-coupants.
- Nettoyage de la table avec des solutions désinfectantes.
- Nettoyage des mains immédiatement à l’eau et au savon.
Il faut s’assurer tous les jours du bon fonctionnement de l’équipement du laboratoire.
Ne pas fumer, ne pas manger dans l’espace de travail.
Stériliser, avec des ultra-violets, l’air et les surfaces de travail.
2) Stérilisation
La stérilisation est l’une des plus grandes réalisations de la microbiologie, étant donné qu’elle a été introduite dans la pratique médicale courante, elle a influencé l’évolution des spécialités chirurgicales, l’épidémiologie des maladies infectieuses, l’hygiène et à peu près toutes les spécialités médicales.
Le mot « stérile » a une origine latine et pourrait se traduire par « infertile ».
La stérilisation, comprend l’ensemble des techniques physiques et chimiques qui éliminent tous les germes viables (bactéries, spores, levures, virus et parasites) d’une surface ou à l’intérieur d’un corps.
Un objet stérile est donc dénué de toute forme de vie. Le critère de vérification de la stérilisation consiste en l’absence de multiplication de micro-organismes, quand ils ont introduits dans un milieu favorable.
La stérilisation ne consiste pas seulement en l’élimination complète des micro- organismes, mais aussi dans la prévention de la recontamination des objets stérilisés.
Dans le choix de la méthode de stérilisation, il faut prendre en compte la qualité physique et chimique des matériaux soumis à la stérilisation, mais aussi la sensibilité des micro-organismes, qui est différente en fonction des divers agents stérilisants.
Face à la méthode de chaleur humide, par exemple, les bactéries thermophiles sporulées peuvent survivre à des températures comprises entre 30°C et 134°C mais elles n’ont pas de réelle importance médicale, du fait de leur température de multiplication de 50°C.
Face aux agents chimiques, les spores de certaines bactéries sont beaucoup plus difficiles à éliminer que leur forme végétative.
Le choix d’un antiseptique ou désinfectant nécessite donc une connaissance précise de la résistance des micro-organismes potentiellement présents, tout comme la concentration active des substances respectives.
Dans le processus de stérilisation, il existe quelques règles générales :
- Le matériel stérile à usage unique et les dispositifs utilisés ne doivent jamais être réutilisés,
- Tous les dispositifs médicaux qui doivent être stérilisés, doivent d’abord être nettoyés par des méthodes physiques et désinfectés avant d’être soumis à un processus de stérilisation standardisé,
- L’organisation des activités de stérilisation et activités connexes (de nettoyage, désinfection, etc.), doit tenir compte de la nécessité de respecter les circuits fonctionnels : il est interdit d’effectuer ces activités dans un autre espace que celui destiné à ces opérations.
2.1) La classification des méthodes de stérilisation
Méthodes physiques :
-Stérilisation par chaleur humide : l’autoclave, avec vapeur sous pression, c’est une méthode de choix (si le dispositif médical supporte cette procédure), en règle générale, elle se réalise à une température de 121°C, pendant 30 min et à 1 atm.
Indication de stérilisation à l’autoclave :
- Matériel infectieux de laboratoire,
- Milieux de culture,
- Matériel en coton,
- Objets en caoutchouc.
Il existe aussi les autoclaves « flash » qui s’utilisent surtout en cabinet chirurgical, ainsi, la stérilisation s’effectue à 134°C pendant 4 minutes, les instruments étant utilisables un court instant.
Figure 2 : Exemples d’autoclaves.
- Stérilisation par ébullition : C’est un procédé de fortune.
Il faut remplir un récipient adapté d’eau (de préférence déminéralisée). Ensuite il faut faire attention à ajouter le matériel en verre avant de chauffer l’eau, le matériel métallique peut, quant à lui, être placé directement dans l’eau bouillante.
Pour le matériel de prélèvement, il faut laisser 20 minutes dans l’eau bouillante.
- Stérilisation par chaleur sèche : l’étuve/four Pasteur, se fait à 180°C pendant 1 heure ou à 160°C pendant 2 heures, assurant la carbonisation des formes végétatives et des formes sporulées de tous micro-organismes.
On retire les objets du four lorsque la température de l’air à l’intérieur du four descend aux alentours de 40°C.
Indication de stérilisation au four Pasteur :
- Verrerie de laboratoire,
- Objets en porcelaine,
- Instruments chirurgicaux et de stomatologie,
- Certains matériaux: talc, huiles (paraffine).
Attention, par cette méthode, on ne stérilise pas les solutions aqueuses, les objets en caoutchouc ou en coton, et le matériel contaminé de laboratoire.
Un cycle complet de stérilisation dure 4 à 5 heures, il comprend les phases suivantes :
- Phase de chauffage de l’appareil,
- Phase de latence (intervalle de temps entre le début de la diffusion de la chaleur et l’atteinte de la température de stérilisation),
- Phase de stérilisation (1 heure à 180°C ou 2 heures à 160°C),
- Phase de refroidissement.
Figure 3 : Pupinel (stérilisateur Memmert)
- Stérilisation par flambage : c’est un procédé qui ne doit être utilisé que pour les objets métalliques tels que les pinces ou scalpels, et non pour tout type de matériaux.
On place les instruments dans un plateau en métal, on verse quelques millilitres d’alcool et on enflamme. Pendant le flambage, il faut incliner le plateau dans un sens puis dans l’autre.
Les anses en platine doivent être chauffées à la flamme d’un brûleur à gaz ou d’une lampe à alcool, jusqu’à ce quelles soient portées à rouge.
Méthodes physico-chimiques :
- Stérilisation à l’oxyde d’éthylène (ETO): L’oxyde d’éthylène est un gaz incolore, allergisant, irritant et peut former avec l’air un cocktail explosif. Il a l’avantage de pénétrer rapidement les divers matériaux synthétiques thermoplastiques. Vu sa dangerosité, son utilisation n’est possible que dans des conditions rigoureusement contrôlées.
Les bactéries sont tuées par l’action de l’oxygène de la molécule d’oxyde d’éthylène (CH2OCH2) à une température comprise entre 20 et 60°C.
Indication d’utilisation de l’ETO: pour les objets en plastic, emballés hermétiquement dans des emballages en plastic.
Après stérilisation il faut laisser les matériaux à l’air libre pour éliminer l’ETO résiduel, étant toxique pour la santé.
Cette méthode ne doit être utilisée seulement quand il n’existe pas d’autres moyens de stérilisation.
Mais il est tout de même interdit d’utiliser cette méthode:
- Pour le matériel médico-chirurgical dont la composition n’est pas connue, - Pour la re-stérilisation du matériel constitué de polychlorure de vinyle initialement stérilisé par radiation ionisantes ou rayons gamma.
- Stérilisation au gaz plasma de peroxyde d’hydrogène: c’est une nouvelle technique de stérilisation qui est utilisée pour la stérilisation du matériel qui ne supporte pas l’autoclave. C’est généralement le peroxyde d’hydrogène qui est utilisé comme agent de stérilisation.
Le plasma représente le quatrième état de la matière, étant constitué d’ions, d’électrons et de particules neutres, dans lequel se manifestent des interactions électromagnétiques et est électriquement neutre à l’échelle macroscopique.
Il peut être considéré comme un gaz total, ou partiellement ionisé, globalement neutre d’un point de vue électrique. Cependant, il est considéré comme un état distinct de la matière, ayant des propriétés spécifiques.
La température du plasma obtenue en laboratoire peut prendre des valeurs différentes pour chaque type de particule constituante.
Pour cette raison, la combustion du plasma dépend de nombreux paramètres, (concentration, champ électrique externe), il est impossible d’établir précisément une température à laquelle a lieux le passage de la matière de l’état gazeux à l’état de plasma.
En raison des charges électriques libres, le plasma conduit le courant électrique et est très influencé par les champs magnétiques externes.
2.2) La préparation du matériel pour la stérilisation
La préparation du matériel, des dispositifs, des instruments et de l’équipement médico-chirurgical pour la stérilisation se fait dans un espace définis et spécialement équipé.
La préparation du matériel comprend 6 étapes.
1) Décontamination du matériel :
Elle s’effectue manuellement, immédiatement après utilisation (à la fin d’une opération ou d’une manœuvre médicale) et le plus près possible du lieu où le matériel a été utilisé, pour éviter de contaminer le milieu hospitalier.
Le processus de décontamination se réalise par immersion des dispositifs utilisés dans une solution de détergent-désinfectant, avec comme effet de ramollir et détacher les saletés, en plus de l’action désinfectante.
Seul un objet bien nettoyé peut être stérilisé correctement.
2) Séchage du matériel :
L’instrumentation, les dispositifs et les pièces détachées seront disposés sur un plateau en métal, bois ou plastic, le séchage se faisant à l’aide d’une serviette propre et sans peluches.
3) Assemblage :
Les objets qui ont dû être démontés pour être nettoyés et désinfectés doivent être réassemblés avec attention.
4) Lubrification :
Consiste à graisser les instruments ou l’équipement médical, mais avec une attention particulière sur les articulations mobiles des instruments.
5) Vérification : Doit être vérifié :
-Si le processus de nettoyage a été effectué correctement, -L’intégrité des instruments,
-L’étanchéité et l’intégrité des pièces qui ont nécessité un démontage,
-Si les boites et couvercles de boites, pour l’instrumentation, ne présentent pas de déformations, défaillances ou des traces d’étiquettes précédentes.
Il faut ensuite trier les instruments pour les empaqueter, puis les stériliser.
6) Conditionnement :
Les opérations d’emballage, en vue de la stérilisation des instruments et des équipements médicaux, après que ces derniers aient été triés, vont être effectuées sur une surface destinée spécialement à cette tâche.
Le conditionnement peut se faire dans :
- Un papier spécial pour l’emballage de l’instrumentation ou du matériel textile (pour la stérilisation à la vapeur sous pression),
- Un sac en plastic conçu spécialement pour la stérilisation à l’air chaud ou à l’oxyde d’éthylène, et la stérilisation à la vapeur sous pression.
Le matériel emballé doit ensuite être placé dans des boites, ou paniers, métalliques.
Les paniers ainsi chargés sont finalement introduits dans l’enceinte du stérilisateur.
Il est interdit de réutiliser les sacs et les emballages pour d’autres instruments à stériliser et il est interdit d’utiliser des boites non-perforées pour la stérilisation à l’autoclave.
2.3) Le stockage et conservation du matériel stérilisé, après une opération de stérilisation
Lors de l’extraction du matériel stérilisé de l’autoclave, l’intégrité de l’emballage en papier spécial, ou en plastic, se vérifie visuellement.
Le stockage se fait en suivant les critères suivants : - Dans un lieu sec et réservé à cet usage.
- Dans le respect de la gestion de la rotation du matériel.
- Dans le respect de l’intégrité des emballages et de l’étanchéité des containers.
Pour maintenir la stérilité du matériel qui a été soumis au processus de stérilisation, il est nécessaire d’assurer leur préservation dans des meubles fermés, eux-mêmes désinfectés correctement.
Il est interdit de déposer dans ces armoires d’autres objets. Pour diminuer le risque de contamination du matériel stérile, il faut le manipuler le moins possible et dans un parfait état de propreté.
Les durées de validité du matériel stérile, dans les conditions de conservation correspondantes, sont les suivantes :
- Pour les boites métalliques perforées : 24 heures.
- Pour les instruments emballés dans des sacs en plastic scellés : 2 mois (sauf si le producteur signale une autre durée de validité sur l’emballage).
Les dispositifs médicaux stérilisés doivent être étiquetés avec la date, l’heure et le nom de la personne qui a effectué la stérilisation.
2.4) Contrôle de la stérilisation
Le contrôle de la stérilisation à l’autoclave peut s’effectuer par 3 méthodes : 1) Le test de vérification par pénétration de la vapeur (Bowie & Dick) :
Il est aussi appelé « test dynamique d’élimination de l’air » et il est très sensible.
Il est utilisé pour mettre en évidence l’air résiduel ou les gaz inertes de la chambre de stérilisation (autoclave). Cela empêche l’introduction correcte de la vapeur dans les zones respectives, ce qui met en péril le processus de stérilisation.
C’est un test colorimétrique utilisant un pigment chimique thermo-réactif, susceptible de changer de couleur en fonction des paramètres auxquels il est soumis.
Le pigment vire du bleu clair au vert foncé, de manière uniforme lorsque les trois paramètres de la stérilisation ont été atteints: température, temps et vapeur d’eau saturée.
Figure 4 : Test de stérilisation Bowie & Dick.
2) Indicateurs physico-chimiques :
Les indicateurs physico-chimiques pour le contrôle de la stérilisation se présentent sous différentes formes: bandelettes adhésives avec indicateur, sacs avec marqueurs de couleurs et étiquettes indicatrices.
Ces indicateurs se placent dans chaque boite et se vérifient à l’ouverture de tous les paquets stérilisés.
Mais le virement de couleur des indicateurs physico-chimiques ne garantie pas forcément une stérilisation correcte, la sensibilité n’est donc pas très élevée.
3) Indicateurs biologiques :
Les indicateurs biologiques sont des tests biologiques pour le contrôle de l’efficacité de la stérilisation, qui contiennent des spores du genre Geobacillus stearothermophilus et Bacillus subtilis. Ils se présentent sous forme de:
- Fiole en plastic thermorésistant avec à l’intérieur une bandelette imprégnée avec Geobacillus stearothermophilus pour la stérilisation à l’autoclave ou pour la stérilisation au plasma.
- Bandelette imprégnée avec Bacillus subtilis, pour la stérilisation au four Pasteur.
La réalisation du contrôle bactériologique de la stérilisation se fait en plaçant au moins deux indicateurs biologiques, une fois par semaine.
Dans le cas où les tests sont positifs, c’est à dire si il y a croissance bactérienne, il faut réviser immédiatement les appareils de stérilisation.
3) Antiseptiques et désinfectants
3.1) Définitions
La décontamination représente tous les moyens utilisés pour l’élimination et la destruction des micro-organismes (ce qui comprend: nettoyage désinfection et stérilisation).
Le nettoyage est l’étape préliminaire obligatoire, permanente et systémique dans toute les activités ou procédures d’élimination de souillure (matière organique ou inorganique), d’une surface, y compris les téguments, ou d’un objet. Le nettoyage s’effectue par action mécanique ou manuelle, utilisant des agents chimiques ou physiques, et s’effectue dans les unités sanitaires de tous types pour assurer le déroulement optimal de l’activité médicale.
Normalement, elle est suivie par la désinfection, et la stérilisation.
La désinfection est la procédure pour la destruction de la majorité des micro- organismes de toutes les surfaces (y compris les téguments), utilisant des agents physiques et/ou chimiques.
Les germicides sont des substances qui détruisent les micro-organismes mais pas tous les spores bactériens. Leur effet peut être bactéricide, bactériostatique, sporicide, tuberculocide, fongicide et virucide.
On distingue :
- Les antiseptiques : utilisés pour les tissus vivants (téguments, muqueuse, plaies), car peu toxiques pour l’organisme.
- Les désinfectants: substances très puissantes à des concentrations relativement élevées, mais possèdent des effets toxiques ou irritants sur les tissus humains.
On les utilise seulement pour les objets et les surfaces.
Certaines substances, en fonction de la concentration, peuvent être considérées comme antiseptiques ou désinfectant (Chloramine B).
Les biofilms: Ce sont des couches de micro-organismes qui adhèrent fortement aux surfaces organiques ou inorganiques, et qui sont très résistantes aux substances biocides.
La stérilisation est l’opération visant à détruire tous les micro-organismes (y compris les spores bactériens, en fonction de la méthode utilisée) sur les objets contaminés, le résultat étant l’état de stérilité.
3.2) Nettoyage
Pour le nettoyage on utilise simplement une brosse humide (manuelle ou automatique), en bon état et propre, ustensiles et produits de nettoyages, et en respectant certaines règles :
- Le respect des instructions et recommandations du producteur,
- Si le produit doit être dilué, il ne faut pas le conserver ainsi, mais l’utiliser directement après la dilution, sans le conserver,
- Les récipients doivent être étiquetés avec le nom du produit et la date d’expiration,
- Il est interdit de mélanger les produits,
- Le port d’équipement de protection est obligatoire,
- Le personnel qui utilise ces produits doit y être spécialement formé.
Il est préférable que les opérations de nettoyage commencent dans les zones les moins contaminées et progressent vers les zones les plus contaminées.
3.3) Désinfection
La désinfection est la procédure qui s’applique seulement après le nettoyage (et dans certains cas, est suivie du rinçage). Exception faite pour les supports contaminés par des produits biologiques, dans cette situation, la première étape est la désinfection, suivie par le nettoyage et enfin une deuxième étape de désinfection.
Dans toutes les activités de désinfection, il faut appliquer les mesures de protection du travail, pour éviter les accidents et intoxications.
Désinfection par chaleur sèche ou flambage: cette technique n’est utilisée que dans le laboratoire de microbiologie (pour désinfecter les anses ou le goulot des flacons en verre).
Désinfection par chaleur humide: ne s’utilise que dans le cas du lavage automatisé du linge et de la verrerie, dans des conditions de température aux alentours de 90°C.
Désinfection aux rayons ultra-violets: n’est indiqué que pour la désinfection des surfaces lisses et de l’air, dans les box de laboratoire, salles d’opérations, ou autres espaces fermés, pour compléter les mesures de nettoyage et de désinfection chimique.
Désinfection aux produits chimiques : Se réalise par l’utilisation de produits biocides de type 1 et 2 ;
- Les produits de type 1 sont utilisés pour la désinfection des mains et des peaux intactes,
- Les produits de type 2 sont utilisés pour la désinfection des surfaces et la désinfection manuelle des dispositifs médicaux, désinfection par immersion, désinfection par appareils automatiques. Mais aussi la désinfection du linge.
Il existe 3 niveaux de désinfection, en fonction des substances utilisées, des concentrations et du temps de contact:
- Désinfection de haut niveau: réalise la destruction des bactéries sous forme végétative, des champignons, des virus, des mycobactéries et la majorité des spores bactériens.
Cette forme de désinfection peut aussi s’appliquer aux dispositifs médicaux réutilisables, destinés aux manœuvres invasives, et qui ne supportent pas l’autoclave.
Les produits de ce niveau sont enregistrés dans le « registre de désinfection de haut niveau ».
- Désinfection de niveau intermédiaire: réalise la destruction des bactéries sous forme végétative, des champignons, des mycobactéries et des virus, mais n’agit pas sur les spores bactériens.
- Désinfection de faible niveau: réalise la destruction de la majorité des bactéries sous forme végétative, des certains champignons, de certains virus mais n’agit pas sur les spores bactériens, les mycobactéries et virus non-enveloppés.
Les solutions chimiques pour la désinfection de haut niveau doivent être utilisées sous 48 heures ou après 30 cycles d’utilisation.
Figure 5 : Flacons avec divers désinfectants (HMI Scrub NP, Oxy’Floor et Desderman Pure Gel)
Les critères de choix pour l’utilisation des désinfectants sont :
- Le spectre d’activité adapté aux objectifs fixés,
- Le type d’action,
- En fonction de la section dans laquelle ils sont utilisés, ils doivent avoir une certaine efficacité malgré la présence de substances interférentes (sang, pus, vomi, diarrhée, matières organiques, etc.),
- La rémanence la plus élevée possible sur les surfaces,
- La compatibilité avec le matériel utilisé,
- La dangerosité du produit (toxicité, nocivité, inflammabilité, etc.),
- La facilité d’utilisation,
- La stabilité du produit dans le temps,
- La nature du support qui va être traité,
- La nature biodégradable du produit, en accord avec les exigences du milieu.
Voici quelques substances désinfectantes et leurs propriétés : 1. Chlore (hypochlorite de sodium)
Le chlore est un désinfectant universel, actif contre tous les micro-organismes, mais principalement les bactéries. Il est aussi efficace pour l’inactivation des protéines. On le trouve généralement sous forme d'hypochlorite de sodium, avec des concentrations variables en chlore actif. C'est un oxydant corrosif pour les métaux et toxique pour les voies respiratoires, la peau et les yeux.
Comme désinfectant général, on utilisera une solution à 1 g/litre de chlore actif.
Pour nettoyer du sang répandu ou en présence de grandes quantités de matières organiques, il est recommandé d'utiliser une solution plus concentrée, contenant 5 g/litre de chlore actif.
2. Chloramine
La chloramine en poudre contient environ 25% de chlore actif. Dans la mesure où le chlore est libéré plus lentement qu'avec les hypochlorites, la concentration initiale doit donc être supérieure pour que l'efficacité soit comparable à celle des hypochlorites.
En revanche, les matières organisques n’interfèrent pas autant avec la chloramine en solution qu’avec l’hypochlorite. Elle est recommandée à la concentration de 20 g/litre, en présence ou en l’absence de souillures.
3. Formaldéhyde
Le formaldéhyde est un gaz actif contre absolument tous les micro-organismes sauf à basse température, c'est-à-dire en-dessous de 20°C, et l'humidité relative doit être de 70%.
Il est commercialisé sous forme de polymère solide, le paraformaldéhyde, présenté en flacons ou en comprimés. Ou sous forme de gaz dissous dans l'eau, le formol, à la concentration d'environ 370 g/litre (37%), associé au méthanol (100ml/l) comme stabilisant.
Il est utilisé sous ces deux formes pour la décontamination de l'air mais on peut utiliser le formaldéhyde à 18,5 g/litre comme désinfectant liquide.
Comme la plupart des désinfectants, il est toxique pour la peau, les yeux et les voies respiratoires.
4. Glutaraldéhyde
Le glutaraldéhyde est également actif contre tous les micro-organismes. Il est présenté sous forme de solution à la concentration de 20 g/litre, mais il doit être activé avant son utilisation, au moyen d'un composé bicarbonaté fourni avec le produit. La solution devient alors alcaline. La solution activée doit être utilisée dans les deux semaines. Les solutions de glutaraldéhyde seront jetées si elles deviennent troubles. Le glutaraldéhyde est considéré comme toxique, irritant et mutagène. On évitera d'exposer la peau, les yeux et les voies respiratoires.
5. Alcools et mélanges alcooliques
L'éthanol (alcool éthylique) et le 2-propanol (isopropanol) ont des propriétés désinfectantes comparables. Ils sont actifs contre les formes végétatives des bactéries, champignons, mycobactéries et virus, mais ils sont inefficaces contre les spores. Il est à noter que l’alcool s’évapore rapidement et que son pouvoir désinfectant est supérieur quand il est mélangé avec de l’eau (solution alcoolique à 70% par exemple).
Pur ou trop concentré, il est bien moins efficace, car le manque d’eau libre entraine la sporulation des micro-organismes, qu’il est censé détruire.
Or l’alcool est inefficace contre les formes sporulées, qui ne seront alors pas détruites.
6. Iode et iodophores
L'action de ces désinfectants est comparable à celle du chlore. Les surfaces propres peuvent être traitées efficacement avec des solutions contenant 0,075g/litre d'iode actif, mais la présence de quantités importantes de protéines pose des problèmes. Ils sont utilisés pour le lavage des mains ou comme sporicides. Les iodophores peuvent être dilués dans l'éthanol.
7. Peroxyde d'hydrogène
Le peroxyde d'hydrogène est un désinfectant puissant en raison de ses propriétés oxydantes. Il est utile pour la décontamination des appareils, mais il ne doit pas être utilisé sur l'aluminium, le cuivre, le zinc ou le laiton. Il se présente sous forme de solution à 30% dans l'eau (eau oxygénée) et il est dilué dans cinq fois son volume d'eau pour l'utilisation. Il est instable dans les climats chauds et doit toujours être protégé de la lumière.
Règles générales pour la pratique de la désinfection :
- La désinfection complète le nettoyage mais ne le termine pas et ne remplace pas non plus la stérilisation,
- Pour la désinfection en cas d’épidémie, il faut utiliser un désinfectant qui agit sur l’agent pathogène incriminé ou supposé,
- L’utilisation des désinfectants se fait en respectant les normes de protection du travail, qui préviennent le risque d’accidents et d’intoxications,
- Il est nécessaire d’effectuer un tableau avec l’historique des opérations de nettoyage et de désinfection, comprenant: la date, l’heure, le personnel et le type d’opération,
- Le personnel doit connaître la dénomination du désinfectant, la date de préparation, la concentration et le temps d’action.
En ce qui concerne le matériel qui vient en contact avec les tissus du corps humain, on ne choisira pas les mêmes désinfectants.
C’est pour cela qu’on classifie les surfaces comme suit:
- Critiques : pour les surfaces des instruments qui viennent en contact avec les tissus, voire les pénètrent. Ces dispositifs doivent être stérilisés. (Par exemple: la quasi-totalité du matériel chirurgical, les cathéters cardiaques et urinaires, les endoscopes flexibles ou rigides, etc.)
- Semi-critiques : pour les surfaces qui viennent en contact avec les muqueuses intactes et ne pénètrent pas la barrière tégumentaire, à l’exception de la muqueuse parodontale ou la peau lésée.
(Par exemple: les endoscopes, laryngoscopes, l’équipement d’anesthésie et de respiration assistée, etc.)
- Non-critiques : Pour les surfaces qui ne viennent pas en contact avec le patient ou seulement sur la peau intacte de ce dernier.
(Par exemple: le stéthoscope, les bassines, la manchette du tensiomètre, etc.)
Les surfaces inertes comme les murs, le sol, le mobilier de l’hôpital et les objets sanitaires sont encadrés dans la catégorie non-critique.
Désinfection de l’air :
Moyens physiques : la lampe U.V, qui s’utilise en complément des mesures de nettoyage et de désinfection, car elle n’a qu’une action limitée.
Moyens chimiques : l’application des désinfectants se fait par l’utilisation d’aérosols.
Désinfection des mains :
Le lavage des mains fait partie des Précautions Standard et s’appliquent à tout le personnel médico-sanitaire, administratif, patient, visiteurs, étudiants et volontaires, en vue de la diminution des risques d’apparition des infections associées aux soins médicaux.
Les mains constituent la principale voie de transmission pour de nombreux agents pathogènes d’un patient à l’autre, du personnel aux patients et des patients au personnel.
L’hygiène des mains doit être considérée comme étant la plus importante procédure pour la réduction de la transmission des micro-organismes.
Les mains sont le support d’une flore résiduelle, qui est représentée par les micro-organismes saprophytes, constituant la flore normale des téguments.
Elle a un rôle protecteur et est peu incriminée dans les infections associées aux soins médicaux.
Elles sont tout de même capables d’infecter des milieux normalement stériles (sang, cavités articulaires, plaies, œil, etc.).
Les mains sont aussi le support d’une flore de transition, qui résulte de la contamination occasionnelle des mains par les micro-organismes, en particulier dans le milieu hospitalier.
Cette flore colonise l’épiderme pour une période limitée, mais cause fréquemment des infections nosocomiales du fait de la transmission accidentelle, par contact direct ou indirect (c’est à dire par l’intermédiaire d’un objet ou d’une surface contaminée).
Le lavage des mains devrait s’effectuer dans les circonstances suivantes :
- Avant de rentrer en contact avec le patient,
- Avant les procédures de nettoyage et d’asepsie,
- Après l’exposition aux fluides d’un patient,
- Après le contact avec le patient,
- Après le contact avec les surfaces proches du patient.
4) Milieux de culture
La majorité des bactéries et des champignons peuvent être cultivés en laboratoire sur des milieux inertes, acellulaires, mais le reste des micro- organismes, comme les bactéries parasites intracellulaires obligatoires (rickettsies, chlamydies) et les virus, se cultivent sur des cultures de cellules, dans des œufs embryonnés et animaux de laboratoires.
Il existe des milieux adéquats pour à peu près toutes les bactéries d’intérêt médical, cependant, très peu de bactéries restent impossibles à cultiver par les méthodes usuelles. C’est le cas par exemple de Mycobactérium leprae et Treponema pallidum.
La connaissance des nécessités nutritives des bactéries est donc très importante en bactériologie, car elle est à la base de la préparation des milieux de culture destinés à l’isolation et au développement des micro-organismes dans des conditions artificielles, dans un but diagnostique ou dans un but productif.
L’utilisation de milieux de culture permet l’isolation de micro-organisme en culture « pure », facilitant ainsi leur identification.
On les utilise également, pour tester la sensibilité des micro-organismes aux chimiothérapies anti-infectieuses.
Cela permet donc le choix d’une médication ciblée, dans l’industrie pharmaceutique, pour la production de préparations (vaccins et autres produits biologiques) et pour le contrôle de la colonisation microbienne des surfaces, de l’air, de l’alimentation, de l’eau, etc.
Les milieux de culture répondent aux conditions suivantes :
- Ils doivent être stériles,
- Ils doivent contenir les substances nutritives nécessaires pour la croissance et la multiplication des micro-organismes (eau, carbone et azote, facteurs de croissance, vitamines, etc.),
- Ils doivent avoir un pH optimal, la plupart des germes se développent à un pH compris entre 7,2 et 7,4 mais les germes du genre Brucella, par exemple, se développent à un pH de 6,8,
- Ils doivent être clairs pour permettre la mise en évidence de toutes les modifications produites par les germes, dans le milieu de culture,
- Ils doivent permettre les conditions d’aérobiose ou d’anaérobiose.
4.1) Composition des milieux de culture
Les milieux de culture se préparent à partir de substances biologiques, plus ou moins bien définies chimiquement et qui se retrouvent dans à peu près tous les milieux de cultures.
Dans la recherche, quand on étudie les performances métaboliques des bactéries, il est nécessaire d’utiliser des milieux avec une composition bien définie. Les substances biologiques rencontrées dans la majorité des milieux sont des peptones, des extraits de viande, des extraits de levures, dans lesquels on ajoute des substances comme le chlorure de sodium, des mono/polysaccharides, des vitamines, etc.
Les peptones sont des mélanges de substances obtenues par hydrolyse enzymatique, ou acide, des protéines d’origine animale. Elles n’ont pas de composition chimique clairement définie mais du fait de la présence de protéines et d’acides aminés, elles constituent une source universelle d’azote pour toutes les bactéries cultivables.
Les extraits de viande s’obtiennent par la déshydratation d’une préparation de viande de bœuf. Cette préparation contient des quantités importantes de créatine, xanthine, hypoxanthine, acide urique, urée, glycogène, acide lactique, etc.
Les extraits de levures s’obtiennent par la mise en culture contrôlée de levures et contiennent de nombreuses vitamines, principalement du groupe B.
Le chlorure de sodium s’ajoute à tous les milieux de culture usuels, à une concentration de 0,9%.
Les mono/polysaccharides, certains alcools enrichissent les milieux de cultures car ils constituent une source de carbone facilement accessible pour beaucoup de bactéries.
Dans certains milieux de culture on peut encore ajouter des indicateurs colorimétriques de pH, des agents sélectifs, etc.
Les agents de solidification sont l’agar-agar et la gélatine (plus rarement car certaines bactéries ont la capacité d’hydrolyser la gélatine, qui se liquéfie alors à 37°C, température à laquelle se développent la majorité des bactéries d’intérêt médical).
4.2) Classification des milieux de culture
Les milieux de culture se classifient par divers critères, dont nous étudierons la dimension physique, la complexité et le but pour lequel ils sont utilisés.
En fonction de la provenance, les milieux sont naturels (bouillon, milieux Tarozzi avec blanc d’œuf, Loeffer avec sérum de bœuf et œuf), et synthétiques ou artificiels (milieux Thayer-Martin, MacConkey, etc.).
En fonction de l’état physique, les milieux sont liquides (bouillon, eau peptonée), semi-solides (gélifiés avec 5% d’agar), et solides.
Les milieux liquides : ils ont une large utilisation dans les laboratoires de microbiologie médicale.
Ainsi, certains produits biologiques, comme le sang, destiné aux hémocultures, s’ensemencent sur des milieux liquides.
En outre, les souches microbiennes isolées en culture pure sont soumises à des tests biochimiques, avec pour objectif de les identifier. La majorité de ces tests s’effectue sur des milieux liquides (fermentation des sucres par exemple).
Les milieux liquides offrent, sans aucun doute, les meilleures conditions de croissance et de multiplication des bactéries, mais ils ne peuvent généralement pas être utilisés pour l’isolation d’un micro-organisme, à partir d’un produit biologique qui n’est pas naturellement stérile, sauf si on ajoute un agent sélectif dans le milieu.
Le bouillon s’obtient par décoction de viande à laquelle on ajoute du NaCl et des peptones.
Tous les milieux, pour la culture des bactéries récoltées à partir du sang (hémoculture), ont comme composition de base le bouillon, auquel on ajoute des facteurs X et V, des vitamines B6, K3, des facteurs anticoagulants et inhibiteurs de l’effet bactéricide du sérum, en fonction des germes isolés (aérobies, anaérobies, champignons).
Figure 6 : Milieux de culture liquides : (a) simple-bouillon ; (b) Stockage-
«Microbank» ; (c) Flacons BD BACTEC
Les milieux solides Ils s’obtiennent à partir de milieux liquides gélifiés avec de l’agar-agar (1,5-2%).
L’agar-agar est un gel extrait d’une algue marine rouge, originaire d’Asie. D’un point de vue chimique c’est un polymère d’ester sulfurique et de galactose. Il est insoluble dans l’eau froide mais soluble dans l’eau bouillante. Après refroidissement, il produit une gélification du milieu à concentration 0,5-1%.
L’agar n’a pas de valeur nutritive et contrairement à la gélatine, il n’est pas attaqué par les enzymes bactériennes.
Les milieux solides peuvent s’utiliser en « boites Petri », en tubes (colonne inclinée, colonne droite), ou sur des dispositifs en plastic.
La culture de bactéries sur milieu solide a constitué une avancée déterminante dans le développement de la microbiologie.
L’avantage étant que les bactéries ne se développent pas en mélange, mais en colonies isolées, si elles ont ensemencées avec une technique correcte.
La colonie microbienne est une entité macroscopique (visible à l’œil nu) qui résulte de la multiplication d’un seul micro-organisme.
Les caractères culturels ont une importance particulière dans l’indentification des micro-organismes. Ils donnent des informations sur la forme, la dimension, la consistance, l’activité hémolytique et les modifications que les germes peuvent induire sur les milieux respectifs.
Aussi, la culture sur milieu solide donne la possibilité de compter les germes microbiens issus d’un produit pathologique.
Aspect important, surtout quand le critère d’implication étiologique est numérique (pour les infections urinaires par exemple).
Le milieu solide le plus simple est le milieu « gélose simple ».
La gélose simple se prépare à partir d’un bouillon auquel on ajoute de l’agar- agar (1000ml de bouillon chauffé et 25-30g d’agar-agar).
De nombreux milieux solides ont pour base le milieu gélose: Mueller-Hinton, Chapman, Thayer-Martin, AABTL, ADCL, MacConkey, Hektoen, Sabouraud, Schaedler, etc.
Les milieux semi-solides: Ce sont des milieux avec 0,2-0,5% d’agar-agar, ils s’utilisent pour le maintient de la viabilité des germes, l’étude de leur activité biochimique ou leur mobilité.
Les milieux enrichis: Les milieux simples comme la gélose simple ou le bouillon simple, sont des milieux usuels, sur lesquels se développent la majorité des micro-organismes.
Les besoins en substances nutritives spécifiques de certaines bactéries, ont entrainé l’apparition de milieux de culture « enrichis » contenant: purines, pyrimidines, acides-aminés, facteurs de croissances, etc., car elles sont incapables de les synthétiser.
Le plus utilisé des milieux enrichis est « la gélose sang 5% », qui se prépare par l’ajout de 5ml de sang dans l’agar fondu puis refroidit à 45°C.
Le plus souvent, on utilise du sang de mouton ou de cheval, et plus rarement du sang de lapin.
Sur la gélose sang, on peut observer si les bactéries ensemencées ont une activité hémolytique ou non. Cette activité hémolytique et certains autres caractères culturels peuvent différer en fonction de l’espèce animale d’où provient le sang.
Il est contre-indiqué d’utiliser du sang humain pour la préparation de la gélose- sang. Le sang humain contient des substances antibactériennes qui empêchent le développement de certains germes. Le procédé est pratiqué dans certains laboratoires, par manque de sang de mouton.
La gélose chocolat s’obtient par l’ajout de 10% de sang de mouton dans une gélose simple, chauffée à 60-80°C.
Les milieux de culture peuvent encore être enrichis par l’addition de sucres, ascite, sélénite, thioglycolate, sérum (dans le cas du milieu Loeffer pour les germes du genre Corynebacterium), extraits de levures, œuf, viande, facteurs de croissance X ou V (pour les germes du genre Haemophilus), etc.
En fonction des objectifs pour lesquels on les utilise, les milieux de culture se classent en milieux: de transport, sélectifs, différentiels, et spéciaux.
Les milieux de transport: assurent les conditions optimales pour le maintient de la viabilité des micro-organismes entre le moment du prélèvement et le moment de l’ensemencement.
Figure 7 : Exemples de milieux de transport.
Les milieux sélectifs : favorisent la multiplication d’une seule espèce microbienne, en défaveur de toutes les autres.
Les milieux sélectifs liquides s’appellent « milieux d’enrichissement », ils s’utilisent quand un produit pathologique est polymicrobien et qu’il faut isoler une espèce en culture pure.
Connaissant les particularités métaboliques des espèces isolées, on peut favoriser chaque espèce d’un mélange microbien en intervenant sur les facteurs de sélection chimiques, sur le pH, sur la pression osmotique, sur la température de culture, etc.
Le milieu Mueller-Kauffmann est un exemple de milieu d’enrichissement avec inhibiteurs chimiques.
Pour les milieux sélectifs solides, les critères de sélection sont les mêmes. Le plus souvent, on utilise des antibiotiques comme inhibiteurs chimiques, en tenant compte de la résistance naturelle des diverses espèces microbiennes. Si par exemple, nous voulons isoler des bactéries anaérobies, à Gram négatif, nous ajoutons dans le milieu de la vancomycine, qui est très efficace contre les bactéries à Gram positif.
(La Vancomycine est un antibiotique de réserve pour le SARM.)
En fonction du pouvoir de sélection, on classe les milieux en :
- Milieux hautement sélectifs : Wilson-Blair (pour l’isolation de Salmonelles), Lowenstein-Jensen (pour l’isolation de Mycobacterium tuberculosis), Thayer-Martin (pour l’isolation de Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis).
- Milieux modérément sélectifs : ADCL, Istrati-Meitert (pour l’isolation d’entérobactéries), SS (pour l’isolation de Salmonella sp., Shigella sp.), XLD, Hectoen, etc.
- Milieux faiblement sélectifs : MacConkey, EMB (levin)
Les milieux d’enrichissement et les milieux sélectifs sont utilisés pour l’isolation primaire, c’est à dire directement à partir du produit biologique récolté.
Figure 8 : Milieux sélectifs : (a) SS ; (b) Sabouraud ; (c) agar-Schaedler ; (d) Mueller Hinton.
Les milieux chromogènes sont des milieux sélectifs, qui contiennent des substrats artificiels, qui après hydrolyse par les enzymes bactériennes, produisent des composés colorés.
Ces milieux sont : CPS (pour l’isolation d’entérobactéries), CHROMagar (pour l’isolation et l’identification des espèces de Candida sp., entérobactéries, vibrions, staphylocoques, etc.), Rainbow UTI, Chromogenic UTI.
Figure 9 : Milieux chromogènes: (a) Brillance CRO ; (b) Brillance MRSA ; (c) Brillance VRE.
Les milieux différentiels contiennent des substances pour mettre en évidence certaines enzymes ou toxines bactériennes, et des systèmes indicateurs qui confèrent aux colonies des particularités distinctives, qui permettent de les reconnaitre facilement.
Ces milieux permettent la différenciation d’espèces de bactéries du même genre, mais aussi des espèces de bactéries de genres différents. Ainsi, le milieu gélose- sang est un milieu qui différencie les bactéries hémolytiques des non- hémolytiques.
La mise en évidence des caractères biochimiques (de métabolisme) se réalise en pratique, sur des milieux différentiels solides ou liquides :
- Les milieux polytropes, qui permettent l’identification de plusieurs caractères biochimiques : TSI, MIU, MILF
- Le milieu Simons, qui permet d’identifier les bactéries qui utilisent le citrate comme unique source de carbone.
- Le milieu gélose-esculine, avec de la lysine ou de la phénylalanine.
En pratique, les propriétés nutritives, sélectives et différentielles se rencontrent dans les milieux :
- Wilson Blair: Pour les salmonelles, il contient comme facteur de sélection le vert brillant, le facteur différentiel étant la production de H2S. La réaction indicatrice est la formation de sulfure de bismuth noir avec brillance métallique, par la réduction du sulfite (réaction d’oxydo-réduction).
- Chapman : Pour les Staphylocoques, il est sélectif en raison du sodium. Il permet l’identification des espèces par la réaction de fermentation du mannitol du milieu. S.aureus fermente le mannitol, tandis que S.epidermidis ne le fermente pas.
- Mac Conkey agar : Pour les entérobactéries (grâce aux sels biliaires du milieux qui inhibent la flore à Gram positif et grâce à la fermentation du lactose du milieux), il permet la différenciation des espèces d’E.coli, Klebsiella, Salmonella, Proteus.
- Tous les milieux chromogènes : Ils permettent, sur base de caractères biochimiques, la décomposition de substances chromogènes contenues dans le milieu. Cela permet la différenciation d’espèces d’un même genre, les genres d’unes même famille et les familles entre elles.
Figure 10 : Milieux différentiels (a) Mac Conkey ; (b) Chapman ; (c) CHROMagar UTI ; (d) Gélose-sang.
Dans un intérêt diagnostique, on utilise des milieux de culture déshydratés avec une composition chimique bien définie, incorporés dans de petites cuves en plastic.
Les galeries sont formées de 10, 20, 32 cuvettes, avec des tests d’activité enzymatique, de fermentation des sucres, de catabolisme protéique ou d’acides aminés, permettant, par l’intermédiaire de substances spécifiques et un indicateur de pH, la variation de couleur, facilitant ainsi l’identification des germes. Ces milieux sont regroupés sous l’appellation « Galeries API ».
Figure 11 : Gallerie API, (a) API 20NH, (b) API 10S.
Les milieux spéciaux sont des milieux sur lesquels on ne cultive que certaines bactéries, ou ce sont des milieux avec des indications spéciales :
- Löwenstein Jensen : Pour l’isolation du bacille de Koch,
- Tynsdale et Gundel Tietz : Pour l’isolation du bacille diphtérique, - Bordet-Gengou : Pour la culture du bacille de la toux convulsive, - Sabouraud : Pour la culture des champignons,
- Agar Mueller-Hinton (et dérivés sang, chocolat, etc.): Pour tester la sensibilité (par diffusimétrie) des germes à la chimiothérapie anti-infectieuse,
- Bouillon Mueller-Hinton: pour tester la sensibilité (par dilution) à la chimiothérapie anti-infectieuse,
- Bouillon thioglycolate: pour l’isolation des germes anaérobies à partir du sang (hémoculture).
5) Les principes généraux pour le diagnostic de laboratoire des infections
Le laboratoire de Microbiologie médicale a le rôle de préciser :
- Le diagnostic étiologique d’une infection,
- La sensibilité des bactéries identifiées face aux antimicrobiens,
- L’évolution des espèces et leur résistance face aux antimicrobiens dans un hôpital ou une région.
Les étapes du diagnostic de laboratoire peuvent être représentées par le schéma suivant :
Figure 12 : Les étapes du diagnostic microbiologique
Il est important de noter que :
- La récolte du produit biologique doit se faire avant l’administration d’antibiotiques.
- L’examen macroscopique permet d’orienter le diagnostic.
- Le diagnostic sérologique vise l’identification de la réponse immunitaire humorale, représentée par le titre d’anticorps spécifiques dans le sérum du patient, par réaction d’agglutination, fixation du complément, ELISA, RIA, etc.
6) La récolte et le transport d’échantillons
Le choix de la méthode de récolte, conservation et transport du produit pathologique dépend de la nature du produit, on distingue alors :
- Les produits normalement stériles (sang, LCR, exsudat de séreuse, urine), - Les produits qui se contaminent lors de leur élimination de l’organisme, avec la flore normale de la voie d’élimination (urine, crachat),
- Les produits contaminés (matières fécales, exsudat nasopharyngien, le pus provenant de plaies ou brûlures, secrétions vaginales), et qui peuvent provenir de zones normalement colonisées par des micro-organismes.
La récolte est un point de rencontre entre la clinique et le laboratoire de microbiologie. Si la récolte n’est pas correctement réalisée, aucune technique de laboratoire ne permettra l’identification des germes.
Il faut pour cela connaître :
- Dans quel produit biologique peut se trouver la bactérie suspectée, en fonction de l’étape clinique de l’évolution de la bactérie,
- Quel est le meilleur moment de la journée pour la récolte,
- Si le prélèvement est normalement stérile, ou s’il présente la flore normale, - Quel est le procédé le plus juste pour éviter la contamination du prélèvement, - Quels sont les instruments nécessaires à la réalisation du prélèvement,
- Quelle est la quantité nécessaire pour chaque prélèvement, - Comment conditionner le produit,
- Quel est le temps optimal de transport jusqu’au laboratoire, - Quelles sont les procédures de conservation des prélèvements.
Les produits biologiques doivent être accompagnés d’un bulletin d’analyses dans lequel est inscrit: le nom et le prénom du patient, l’âge, le domicile, le nombre de feuilles d’observation, la section et la date d'admission à l'hôpital, la date et l’heure du prélèvement, le type et la provenance du prélèvement, le diagnostic de présomption et des indications sur le traitement antibiotique.
Les prélèvements pour lesquels est sollicité le laboratoire sont en général : - Les sécrétions, excrétions, humeurs, tissus organiques (pathologiques ou
porteurs sains).
- Les fragments de tissus obtenus par autopsie ou biopsie.
- Les produits alimentaires.
- Les produits pharmaceutiques.
- L’eau, l’air.
Quelques exemples de prélèvements :
- Sécrétions nasales (exsudat nasal): Chez les adultes, le prélèvement se fait avec un tampon nasal stérile (un tampon pour chaque narine).
On immobilise la tête du patient en extension, on introduit délicatement le tampon dans le nez, le long du plancher nasal jusqu’à atteindre la paroi postérieure du nasopharynx.
On le laisse quelques secondes, puis on le tourne doucement pour qu’il soit imprégné d’exsudat, après quoi, on le retire doucement.
La quantité du prélèvement est plus grande si on retire et réinsère le tampon au même endroit, le premier tamponnement stimulant les sécrétions muqueuses nasopharygées. On réintroduit le tampon dans son tube protecteur et on l’envoie immédiatement au laboratoire ou bien on l’introduit dans un liquide conservateur pour le conserver jusqu’à son analyse.
La deuxième façon de récolter se fait en aspirant avec une sonde Nélaton reliée à une seringue.
- Sécrétions pharyngiennes (exsudat pharyngien) : Le prélèvement se fait avec un tampon pharyngien.
Il est préférable de réaliser le prélèvement le matin, à jeun, avant la toilette de la cavité buccale, afin de ne pas diminuer la flore bactérienne en actionnant le nettoyage mécanique muqueux, par le biais de la toilette buccale ou de la mastication.
Sinon il se réalise entre 3 et 4 heures après nettoyage de la cavité buccale, gargarisme avec un antiseptique, ou ingestion d’aliments.
Le patient est assis, le cou en légère extension, la bouche grande ouverte, le pharynx bien éclairé, la base de la langue (face dorsale) maintenue avec une spatule stérile (abaissement de la langue).
On introduit le tampon sans toucher la langue ou le palais (pour ne pas contaminer l’échantillon avec la flore buccale) et encore moins l’uvule (pour ne pas déclencher le réflexe de régurgitation).
On tamponne fermement par un mouvement circulaire et on frotte la surface des amygdales, de la paroi postérieure de pharynx ainsi que les zones enflammées, ulcérées, et avec des sécrétions purulentes.
On retire le tampon avec précaution, on le réintroduit dans le tube protecteur et on l’envoie immédiatement au laboratoire ou bien on l’introduit dans un liquide conservateur pour le conserver jusqu’à son analyse.
- Crachats : Le prélèvement se fait le matin par la toilette des bronches, parce qu'au cours de la nuit, le dépôt de sécrétions est plus abondant.
On peut faire deux types de prélèvement :
Indirect: On demande au patient d’effectuer un rinçage énergique de la cavité buccale avec du sérum physiologique (ne pas utiliser de solution antiseptique), puis de tousser et d’expectorer dans un récipient stérile (boite pétri, verre Berzelius).
Direct : Par bronchoscopie ou pas ponction trachéale.
Chez les enfants on réalise le prélèvement par lavement gastrique ou sondage gastrique car ils ont tendance à avaler le produit de prélèvement.
- Sang : En conditions normales, le sang est stérile, puisqu'il possède la capacité d’éliminer les microbes. En tant que produit pathologique, il peut être prélevé pour examen bactériologique ou sérologique.
Pour l’examen bactériologique, on réalise une hémoculture qui révèle la présence de bactéries dans le sang en ensemençant un échantillon de sang dans un milieu de culture adéquat. Le prélèvement se fait de préférence dès la survenue des premiers frissons (les frissons et la fièvre apparaissent 1à 2 heures après l’arrivée des bactéries dans le sang, moment à partir duquel elles commencent à se multiplier).
On utilise un kit d’hémoculture, qui comprend :
- Une seringue stérile de type Luer de 20 ml équipée d’une aiguille, - Une aiguille de rechange,
- Une compresse stérile,
- Du matériel désinfection des téguments, - Un garrot,
- 3 séries de flacons (type BACTALERT® ou BACTEC®), qui contiennent des milieux de culture liquides pour bactéries aérobies, anaérobies et champignons, - On travaille à l’abri des courants d’air, pour éviter toute contamination
aérienne.
On assoit le patient, le bras détendu pour mettre en évidence les veines du pli du coude. On désinfecte le pli du coude sur une grande surface ainsi que les mains du préleveur, avec une solution iodée, puis avec de l’alcool.
