Med. (1961), 114, 5, 729; 24. IL-\LL J. F. Jr., KLEMM F. K.: J. Appl. Physiol. (1963), 18, 1188; 25 HOFF H. E., DEAVERS S., HUGGINS R. A.: J. Appl. Physiol. (1961), 16, 250; 26. INGRAM D. L., WITTOW G. C.: J. Physiol. (1963), 168/4, 736; 27. JO- HANSSON B. W.: Acta Physiol. Scand. (1963), 58/4, 355. 28. JOHNSON R H., SMITH A. C., SPALDING J.M.K.: J. Physiol. (1963), 169/3, 584; 29. IONESCU V., SUCIU T., DEMETRIU F.: Stud. Cercet. Fiziol. 11958), 3, 377; 30. KEATINGE W. R., EVANS M.: Quart. J. Exp. Physiol. (1961), 46, 83; 31. KEATINGE W. R., McCANCE R. A.: Lancet (1957), 2, 208; 32. McLEAN R., MORITZ A. R., ROOS A.: J. of Clin.
Investig. (1947), 26/3, 497; 33. MEFFERD R. B. jr.: J. Appl. Physicl. (1959), 14, 995;
34. MOSER K. M., PERRY R. B., I.UCHSINGER P. C.: J. Clin. Invest. (1963), 42/5, 626; 35. MURRAY J. F., GOLD PH., JOHNSON L. jr.: J. C!in. Invest. (1963), 42, 1150; 36. POGOROVA A. V.: Dokl. Akad. Nauk. S.S.S.R. (1959), 128, 209; 37. POU- LET G., BERNARD J. P., OLIVIER M.: Joum. de Physiol. (1962), 54, 2, 391; 38.
POULET G., BERNARD J. P.: Journ de Physiol. (1962), 54, 2, 389; 39. RAUTEN- BERG W., SIMON E.: Pfltiger's Arch. (1963), 277/2, 214; 40. ROBERT W., BEA- VERS J. T. ROGERS: Amer. J. Physiol. (1959), 196, 706; 41. RUBENSTEIN E., LACK A.: J. Appl Physiol. (1960), 15, 598; 42. SEK M. T.: Fiz. Journ. (1961), 47, 5, 612;
43. SIRCAR P.: Proc. Soc. Exper. Biol. Med. (1954), 87, 194; 44. SLANIM A. D.: Fed.
Prcc. (1963), 22, 732; 45. SPEALMAN C. R., YAMATO W., BIXHY E. W., NEWTON M.: Amer. J. Physiol. (1948), 152/2, 233; 46. SPURR G. B., HOH B. K., HORVATH S. M.: Amer. J. Physiol. (1954), 179, 139; 47. ULMER F., KOANIG W .. BINDER E., HENDRICK H.W.G.: Pfltiger's Arch. (1962), 276/1, 66; 48. WERNER A. I., DEWSON D., HARDENBERGH E.: Science (1956), 124, 1145; 49. YANNET H., DARROW D. C.:
J. of Biol. Chem. (1938), 123, 295.
Disciplina de microbiologie şi inframicrobiologie stomatologică (cond.: şef de lucrări
'Al. Abrahâm, doctor in medicină), Disciplina de microbiologie ~ inframicrobiologie (cond.: conf. I. Lâszl6) şi Catedra de fiziologie (cond.: conf. Gh. Arsenescu,
doctor in medicină) ale I.M.F. Tg.-Mureş
STUDIUL FACTORILOR HEMOLmCI EXTRASI DIN TULPINI DE ESCH. COLI
Nota Il
Monica Sabău, L. Domokos, A. Kapusi, Ecaterina Luktics
Germenii aparţinînd grupului Esch. coli sint microorganisme comensale,
con5tituenţi obişnuiţi ai florei normale a corpului, care în anumite condiţii pot dovedi o capacitate marcată de patogenitate, putînd determina infecţii urinare, intestinale. peritonite, apendicite sau septicemii cu localizări secundare in dife- rite organe. Au rămas însă numeroase tulpini de colibacili, patogenitatea cărora nu este încă precizată. Astfel, tulpinile hemolitice sint adesea incriminate in
provocarea proceselor morbide la om (1, 2, 3, 4. 5, 8) si la animale (6, 11, 13, 14, 15, 22, 23).
S-au făcut o serie de încercări pentru a izola principiul hemolitic din aceste tulpini (9. 19, 21).
In lucrările noastre anterioare (16. 17, 18) am studiat tulpinile hemolitice izo..
late de la cazuri cu enterocolită şi am reuşit să izolăm factorul hemolitic după me- toda preconizată de Smith (19) şi prin precipitare cu alcool ,absolut. Patogenitatea acestui factor am determinat-o la şoareci albi şi actiunea lui dennonecrotică la robai şi iepuri, iar dinamica anticorpilor la animale imunizate.
54
1
- . . - .,.
In continuarea preocupărilor noastre de acest gen am experimentat şi alte posibilităţi de izolare a factorului hemolitic din tulpini de Esch. coli. proprie- tăţile şi natura lui.
Material şi metodă
Tulpinile hemolitice de Esch. coli au fost izolate din materii fecale ale copii- lor cu enteroeolite, identificate morfologic, serologie. biochimie şi din punct de ve- dere al caracterelor de cultură.
Bulionului cu proteoză-peptona, preconizat de Smith (19) - pentru obţinerea
hemolizinei - am căutat să-i aducem unele îmbunătăţiri prin adaos de hidroliza, de cazeină 10% şi diverşi carbohidraţi (glucoză. lactoză, manită, maltoză) i•l con-
centraţie de 0.2% avînd un pH final de 7,4.
Dir. tulpinile de Esch. coli s-au însămînţat în 10 mi din buhonul menţiO
nat 5Xl07 organisme viabile pe mi stabilite prin nefelometrie, incubate La 37° timp de 2 ore şi jumătate. Ulterior cultura a CO"t centrifugată 60 min la 7000 turaţii/min.
şi filtrată pri'l filtrul Seitz.
Titrarea factorului hemolitic s-;;. fă:ut după pnx:e<ieul descris (16), dar s-au ut:lizat pe lîngă hematii de oaie şi hel!Vltii de iepure şi de om grupa O. Tuburile conţinînd diluţii succesive din factorul hemolitic şi hematii de oaie, iepure şi om 1% au fost incubate 2 ore la baie> marină. iar ulterio1· au fost menţinute 18 ore la +4°.
Sensibilitatea faţă de căldură s-a determinat. menţinînd centrifugatul culturi- lor la 56° timp de 30 minute şi 10 minute la 70°, iar sensibilitatea fată de formol prin adi ţie de formalină în concentraţie de 1 ";..
Pe baza sensibilităţii factorului hemolitic faţă de căldură, faţă de formahnt., a precipitării in prezenţa alcoolului absolut şi a acidului trictm·acetic, presupunind
că este de natură proteică, am efectuat şi studiul refractometric şi electroforctic al acestuia. Pentru studiul electroforetic am utilizat supernatantul a 2 cultmi, concen- trat de 10 ori în saci de colodiu. faţă de soluţia tampon; hîrtie Whatman 1 şi so-
luţie tampon medinal-veronal la pH 8,6. Din IT'aterialul studiat s-a aplicat pe fie·
care bandă 0,3 rnl {3 spoturi de pornire unul deasupra celuilalt), intensitatea curen- tului folosit fiind de 1,2 mA pe bandă. După 5 ore benzile au fost uscate, fixate 10 min. la 110° şi colorate după metoda Lozsa (10) cu fuxină acidă Geigy, iar eva- luarea s-a făcut la evaluatorul automat ERI-10 Zeiss-Jena. De asemenea s-a efec- tuat şi electroforeza în gel de amidon după metoda Smithies (20)
Discutarea rezultatelor
Rezultatele lucrărilor noastre anterioare (16, 17, 18) au scos în evidenţă faptul că factorul hemolitic izolat (presupusa hemolizină alfa) se găseşte în cantitate mai mare in supernatantul culturilor de Esch. coli hemolitic in bu- lion Smith decît în filtrat. după o incubare de 2 ore şi jumătate b 37°. Această perio.adă a fost probabil apropiată de faza logaritmică de creştere a germe- nilor.
Titrul hemolizinei. obţinut prin cultivarea tulpinilor în bulionul Smith, a fost de l/G4, iar cel obtinut prin utilizarea mediului imbcgăţit cu hidroli- zat de cazeină 1/128-11256. Compararea aCI"Stor titruri ne rcliefează faptul că hidrolizatul de cazeină favorizează producerea de hemolizină. Creşterea titrului hemolitic a fost înregistrată după menţinerea tuburilor timp de 11!
ore la +4°.
In lucrările sale Snyder şi Koch (21) relatează posibilitatea de izolare a două hemolizine. una filirabilă si una nefiltrabilă, în mediul "definit chimic"
la care s-a adăugat glucoză. maltoză. sorbitol. lactoză, galactoză, manoză şi manitol. Hemolizina filtrabilă s-a produs în prezenţa glucozei. lactozei. mani- tolului. dar nu s-a prod\13 în prt-zenta 1plactozei, manozei. sorbitulului. He- molizina nefiltrabilă s-a produs în prt-zenta tuturor carbohidraţilor.
55
- ~~-~ ~;r ,-• ~ -·~...,...,-.--:·- 1
Carbohidraţii adiţion:Jţi de noi la mediul de bază. au stimulat in egală mJ.sură producerea factorului hemolitic.
Referindu-ne la natura hematiilor utilizate în reacţia de hemoliză, am constatat că cele mai sensibile au fost cel~ de oaie şi de om la care s-a obţi
nut un titru maxim de 11256 fată de cele de iepure cu titru mult mai scăzut
1/32-1/64.
Terrnolabilitatea hemolizinei alfa a fost menţionată de Ishii Fujio (7) şi de Snyder şi Koch (21) care menţionează că termolabilitatea este în funcţie atît de tipul hemolizinei cît şi de mediul utilizat pentru producerea ei. ln acest sens ei arată că hemolizinele, atit cea filtrabilă, cît şi cea ncfiltrabtlă, obţinute prin cultivarea tulpinilor pe m~iul cu inimă de bou sint labile, pe cînd în mediul cu hidrolizat de cazeină şi mediul ,.definit chimic" numai hemolizina nefiltrabilă este labilă.
Menţinînd supernatantul culturilor hemolitice h temperatura de 56° şi 70° şi efectuînd ulterior reacţia de hemoliză, noi am constatat inhibarea ac- tiunii hemolitice a factorului hemolitic. De asemenea inocularea factorului hemolitic supus acţiunii căldurii a rămas la şoarecii albi fără efect in com-
paraţie cu utilizarea lui ca atare (tabelul nr. 1 şi 2).
Tabelul nr. 1.
Efectul temperaturii asupra hemolizinei
- - - - - -
1 '6-8h 1
1 Materialul Nr. anim. Decese Supra- Total Decese
inoculat inoculate
i.p. 8-24 h 24-48 h vieţuiri decese ",(,
--
- -1 Centrifugat
la 56° C 30' 25
- -
2 23 2 8Centrifugat la 70° C 10'
1 25 1
- - -
25 1o o
Tabelul nT. 2.
Patogenitatea filtrului şi centrifugatului la şoareci
' i
Materialul Nr_ anim_ r Decese 1
Supra- Total Decese inoculat inoculate 6-8 h 8-24 h 24-48 h vieţuiri dece,se %
1
Centrifugat i. p. 25 2 16 6 1 24 96
Filtrat i. p. 25
- -
1 24 1 4Centrifugat i. v_ 25 15 111
- -
25 100Filtrat i. v. 25
-
2 2 21 4 16- - - -- -
Pe baza acestor observaţii, coroborate cu cele menţionate mai sus, presu- punem natura proteică a factorului hemolitic, refractometria şi electroforeza confirmindu-ne această ipoteză.
1
Studiul refractometric a indicat un indice de refractie corespunzător unei
concentraţii de 4,8 g% proteină, faţă de soluţia martor (bulionul Smith) care a prezentat un indice de refracţie puţin superior celui al apei distilate. Factorul he- molitic extras din cele două tulpini a prezentat la .examenul electroforetic patru
56
MONICA SABAU ŞI COLA.B.: STUDIUL FACTORILOR HE!.MOUTICI E!.XTRA$1 DIN TULPINI DE E.SCH. COLI
Fit:. "'· 1: Electroforegrama factorului bemo·
li tic
'
·: • .. '·~ ···, .o -, · ~· · ··:·· · ·: ·
~~- .. .-~;.
: .
::; .'"7 ..... . • • ~ • ''"
. .
.·. ·
. ./'.. .
. ..
'· .
" :
•
. .Fi11. nr. z: Elcctroforcza pe gel de amidon a factorului
hemolitic
j '
• . • +="'
1 ~ •fracţiuni: fracţiunea 1 cu mobilitatea cea mai mare a prezentat 18%, respectiv 19%; fracţiunea II a reprezentat 16%, respectiv 17%; fracţiunea III 36%, res- pectiv 37%, iar fracţiunea IV 28%, respectiv 29% (fig. 1). Electroforeza solu- ţiei martore a pus in evidenţă două fracţiuni distincte, prima plasindu-se in zona albuminelor. iar cea de a doua in zona globulinelor, însă foarte slab colorate.
Electroforeza in gel de amidon ne-a furnizat date similare (fig. 2). Pe
lîngă cele patru fracţiuni s-a pus in evidenţă însă o fracţiune in plus cu mig- rare spre catod. Pe baza vitezei de migrare in cimpul electric aplicat, com- parativ cu studiul electroforeogramei proteinelor serice obişnuite, fracţiunea 1 a factorului hemolitic, studiat de noi. p~zintă o mobilitate identică cu a alburninelor. iar fracţiunile II, III, IV au mobilităţi care se înregistrează in cadrul globulinelor serice. Prezenţa fracţiunilor cu proprietăţi electrice ase- mănătoare globulinelor este dovedită şi de apariţia IX' gel d:o- amidon, a unei noi fracţiuni (fracţiun~a V cu migrare spre catod).
Referindu-se la studiul electroforetic al neurotoxinei "S" ŞI "R" a germenilor gram negativi, L. Mesrobeanu şi colab. (12) au pus în evidenţă Ia aceasta trei flac-
ţiuni, fiind in studiu iwlarea acestora cu ajutorul electroforezei preparative ŞI pe
coloană de Sephadex.
Rezultatele obţinute de noi ne permit să conchidem următoarele:
- adăugarea la mediul de bază Smith a hidrolizatului de cazeină şi a diverşilor carbohidraţi favorizează producerea in cantitate mai mare a hemo- lizinei;
- cele mai sensibile hematii fată de factorul hemolitic sint hematiile de oaie şi om grupa O. Cele de iepure sint mai puţin sensibile;
- factorul hemolilic este termolabil. activitatea lui hemolitică fimd de asemenea inhibată de acţiunea formalinei;
- pe baza cercetărilor electroforetice presupunem că factorul hemolitic este de natură proteică.
Sosit la redacţie: 28 noiembrie 1966.
Bibliografie
1. BERCOVICI C., COHAN A .. DIMITRIU N., CIRDEI 1., BALTIEV A., COR- BER S., BEŞLEAGĂ V.: Microbiologia (1958), 3, 227; 2. BERGNER E., STERN A., VANCEA D.: Microbiol., Parazitol, Epidemiol, (1965), 1, 10, 41; 3. CASELITZ F. H., KITTELH H.: Ex. Me<iica (1960), 3, 8, 855; 4. DUDGEON, PULBERTAPHT cit.
TOPLEY WILSON: Principles of Bacteriology and Imunology, London (1955); 5.
GUNDEL M.: Die Ansteckenden Krankheiten (1942); 6. GREGORY D. W.: Bull. I.P.
(1963), 61, 10, 2978; 7. ISHII F.: Japan J. Microb. (1960), 4, 2, 203; 8. KAUFFMANN:
Acta path. microbiol. scand. (1948), 25, 4, W2; 9. LOVELL R., REES T. A.: Nature (1960), 188, 4752, 755; 10. LOZSA A.· Kiserletes orvostudomâny (1961), 13, 98; 11.
MANSSON 1.: Acta Vet. Scand. (1962), 3, 1, 65; 12. MESROBEANU L., MESRO- BEANU 1., MITRICA N., CROITORESCU 1., MARX A.: Arch. roum. Path. exp.
(1963), 22, 3, 775; 13. MIURA S., S'\TO G., ITO M., lVIIYAMAE H., SAKAZAKI R.:
Japan J. Vet. Rcs. (1961), 9, 3, 145; 14. RICHARDS W.PC., FRASER C. M.: Bull. L.
P. (1960), 59, 11, 3501; 15. ROBERTS H. E., WALLELY T. F.: Buii. I. P. (1960), 7, 2140; 16. SABĂU M., DOMOKOS L., ABRAHAM A., NAGY L.: Microbiol. Parazitol.
Epidemiol. (1960), 10, 1, 41; 17. SABĂU M., DOMOKOS L., ABRAHAM A., KAPUSI A Congr.: N:1ţ10nal de microbiologie, Bucureşti (1965); 18. SABAU M., DOMOKOS L .. ABRAHAM A., KAPUSI A.: Sesiunea V-a I.M.F. Tg.-Mureş (1965); 19. SMITH H. W.: J. Path. Bact. (1963), 85, 1. 197; 20. SMITHIES 0.: Biochem. J. (1955), 61, 62!1;
21. SNYDER 1. S., KOCH A. N.: Journal of Bact. (1()66), 91, 2, 763; 22. ZIMMER- BACHEL W.: Ex. Medica IV. (1964), (10), 1116; 23. WILLINGER H.: Ex. medico.
(1965), 18, 4, 517.
5 57
